Den Viren nachempfunden: die effiziente Modifikation von Säugerzellen

Sandra Götze, Martin Klar, Karin Maaß, Kristina Nehlsen, André Oumard, Silke Winkelmann und Jürgen Bode, GBF, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Epigenetische Regulation, 38124 Braunschweig; jbo@gbf.de
http://karinmaass.de.ms, eine Sonderseite zum 25jährigen Dienstjubilum von Karin Maaß am 16. Okt. 2003, verbunden mit vielen Glückwünschen und herzlichem Dank

Die erfolgreiche genetische Modifikation höherer Zellen erfordert die langfristig stabile Übersetzung (Expression) des übertragenen Gens. Vektoren, mit denen biotechnologisch oder auch therapeutisch relevante Gene eingeführt werden, verbinden sich typischerweise mit den Chromosomen, wobei der Integrationsort ihre Eigenschaften bestimmt. Strategien von Viren und Hefen weisen den Weg zu neuen Vektorgenerationen, die den Ausbau und die wiederholte Nutzung einmal gefundener und charakterisierter, geeigneter Integrationsstellen ermöglichen.

Die unbefriedigende Ausgangssituation
Die klassischen Techniken des Gentransfers sind wenig effizient und zuverlässig: das Ziel einer Integration des “Transgens” in einen vorteilhaften chromosomalen Ort wird so selten erreicht, dass stets umfangreiche Selektionsarbeiten vorgenommen werden müssen. Wenn Integration erfolgt, dann zumeist in hoher Kopienzahl und in einer Anordnung, gegen die die Wirtszelle Abwehrmechanismen entwickelt hat. Unerwünschte Mutationen und genomische Instabilität können die Folge sein. Das erstrebte Ziel einer vorhersagbaren, langfristig stabilen und bei gentherapeutischen Ansätzen sicheren Modifikation wird so nur zufällig erreicht.

Viel hilft nicht viel: eine Kopie am richtigen Ort ist besser
Somit rücken wir heute zunehmend von der Idee ab, dass zahlreiche Genkopien eine hohe Expressionsleistung versprechen. Indizien hierfür wurden zunächst für Pflanzen beobachtet und als “Cosuppression” bezeichnet. Neue Daten zeigen dieses Phänomen auch für tierische Zellen. Abhilfe kann nur durch Berücksichtigung chromosomaler Ordnungsprinzipien beim Design von Vektoren erwartet werden. Aufschlussreich sind in diesem Zusammenhang Strategien, die Viren zur Realisierung ihrer genetische Information entwickelt haben.

Das kontroverse, aber hilfreiche Konzept der Kernmatrix: S/MARs als Werkzeuge
Die kernhaltigen Zellen höherer Lebewesen (Eukaryonten) sind deutlich komplizierter aufgebaut als jene von Bakterien [1]. Der grundlegende Unterschied ist die Kernmembran, die die DNA vom Cytoplasma separiert. Jedes der 46 Chromosomen einer menschlichen Zelle enthält zwischen 48 und 240 Millionen Basenpaaren das entspricht 1,6- 8,2 cm, insgesamt 2 m an DNA. Wie kann ein Faden dieser Länge in einem Kern mit 5-30 Mikrometer Durchmesser verschwinden? Das Geheimnis sind die Ordnungsprinzipien des Chromatins, eines Komplexes aus DNA, RNA und Proteinen, die eine gesetzmäßige Faltung in mehreren Stufen ermöglichen. Die untersten Verpackungsstufen führen wir mit Abb. 1 ein, darunter das 1974 entdeckte “Nucleosom”, ein Proteinkomplex um den die DNA in etwa zwei Windungen gewickelt ist. Die insgesamt 25 Millionen Nucleosomen einer Säugerzelle wiederum sind in Form von 30 000 Schlaufen-förmigen “Chromatindomänen” organisiert. Einem klassischen Modell zufolge wird diese Schlaufenorganisation durch Anheftung bestimmter DNA-Elemente, die wir als S/MARs (´scaffold/matrix attachment´ Regionen) bezeichnet haben, an das Proteinrückgrat des Zellkerns (die “Kernmatrix”; graue Felder) aufrechterhalten. Neuere Untersuchungen weisen auf eine beträchtliche Dynamik dieses komplexen Gebildes hin, die von der Art und dem Differenzierungszustand der Zelle mitbestimmt wird.

Abb. 1:

Neuartige Chromosomen-basierte Strategien zur Vermeidung von Positionseffekten. Neben der direkten Verwendung genomischer Isolatoren (1; S/MARs) gemäß Abb. 2 lassen sich die durch Retroviren (2) entwickelten Strategien nutzen, welche "provirale DNA" in transkriptionell begünstigte Genorte inserieren. Gibt man seinem Genkonstrukt "molekulare Adressen", d.h. den im Text beschriebenen Satz von Rekombinase -Erkennungsstellen (Halbpfeile; Abb. 3) mit, so kann ein einmal definierter genomischer Ort nach dem "RMCE" -Verfahren immer wieder angesteuert werden. Der Strategie von DNA -Viren nachempfunden, werden derzeit auch nichtintegrierende Vektoren (zirkuläre Episomen) auf der Grundlage eines S/MAR -Elementes entwickelt (4).

 

 

 

 

Im Genom wechseln sich unzugängliche, inaktive Bereiche mit aktiv transkribierten Chromatindomänen ab. Untersuchungen der Histon- und DNA Modifikationen zeigen, dass inaktive und aktive Abschnitte voneinander getrennt sind und nicht aufeinander einwirken können. Dies hat schon früh dazu geführt, die Existenz genomischer “Isolatoren” (´insulators´) zu postulieren. Dieses rasch expandierende Feld kann hier nicht eingehend behandelt werden, jedoch zeigen unsere Untersuchungen, dass S/MARs sich unter den Elementen befinden, welche die Rolle von Isolatoren übernehmen können. Damit waren Werkzeuge entdeckt, die sich für die Konstruktion neuer Vektorgenerationen anboten. Diese Aussagen sollen in Abb. 2 als Zusammenschnitt typischer Phänomene vertieft werden . Die zentralen Darstellungen (B, B´) fassen die Problematikzusammen:

Abb. 2:

Genetische Modifikation von Säugerzellen. Mit herkömmlichen Techniken kann weder die Zahl, noch der Integrationsort transferierter Gene (und damit Expressionshöhe bzw. Stabilität) bestimmt werden. Für Einzelkopie -Integrate bewährt es sich, das Gen durch genomische Isolatoren (hier: S/MARs) zu flankieren: Balkendiagramme zeigen die Expressionshöhe von Einzelklonen in Abwesenheit (links) bzw. Anwesenheit (rechts) solcher Elemente; die logarithmisch skalierte Ordinate zeigt die Expression des Luciferase -Reportergens. Helle Balken zeigen, dass 2 -4 Kopien einzelnen Kopien in ihren Eigenschaften nicht überlegen sind. Die zentrale Grafik symbolisiert die Assoziation genomischer Abschnitte mit der Kernmatrix (schraffierter Kreis). Die Fluoreszenzaufnahme weist nach, dass Einzelkopien (grünes Signal) mit der Matrix (blau leuchtendes Zentrum) assoziieren, während dies für multiple Kopien (rote Schlaufe) nur sehr eingeschränkt möglich ist.

 

     - ein Vektor gelangt auf weitgehend unbestimmbarem Weg in den Zellkern und verbindet sich mit der zellulären DNA. Ob diese Integration in transkriptionell aktive oder inaktive Domänen erfolgt, entzog sich bis vor kurzem weitgehend der Kontrolle; 

    - nur die Integration in kleine Domänen und dort in Matrix-nahe Bereiche ermöglicht die Hochexpression, allerdings nur, wenn die Zahl integrierter Kopien begrenzt ist.

Abb. 2B´ zeigt eine Mauszelle die durch schonende Extraktion in einen “Kernmatrix-Bereich” (hellblau fluoreszierendes Zentrum) und den “Halo-Bereich” (aus freiliegenden DNA-Schlaufen bestehender Lichthof) separiert werden konnte [2]. Das hellgrüne Signal weist auf Kernmatrixassoziation einer Klasse endogener Mausgene hin. Dagegen kennzeichnet das rote Signal das Schicksal von 100 transferierten Kopien eines humanen Gens, von denen nur ein geringer Teil Bindungsplätze an der Kernmatrix erreicht. Diese Befunde erklären die "Cosuppression": nur Kopien an der Kernmatrix finden den Transkriptionsapparat, während "freischwebende" Kopien durch Mechanismen wie DNA Methylierung ruhiggestellt werden.

In den Teilen A und A´ werden Aktivitäten von S/MAR-Elementen dokumentiert:
Untersucht man die Expression von “nackten” Einzelkopie-Integraten eines Reportergens (Luciferase = Luc, dunkle Balken) so findet man, dass die Expression - in Abhängigkeit vom Integrationsort - um bis zu vier Größenordnungen variiert. Eine Steigerung der Kopienzahl (helle Balken) ändert diese Verhältnisse nicht. Schafft man hingegen eine kĂĽnstliche “Minidomäne” S/MAR-Luc-SMAR, in der Luc durch S/MARs eingerahmt wird, so zeigen alle Einzelkopie-Klone nicht nur eine höhere, sondern auch gleichmäßigere Expression (dunkle Balken). Dieser als “Augmentation” bezeichnete Einfluss ist nicht nur vorĂĽbergehend, er bleibt auch langfristig erhalten. Wie in A zeigen erhöhte Kopienzahlen keinen Effekt, da auch hier die Zahl der (lokal verfĂĽgbaren) Bindungsplätze an der Kernmatrix begrenzt ist. 

Viren als Lehrmeister
Viren haben eine Vielzahl von Strategien für ihr eigenes Überleben entwickelt, mit denen sie sich den Abwehrmechanismen der Wirtszelle entziehen. Sie benutzen den mitotischen Apparat der Zelle, um ihre gleichmäßige Verteilung auf Tochterzellen (Segregation) zu gewährleisten. Zwei Strategien waren für unsere Arbeiten wegweisend:

- Retroviren
Diese Gruppe besitzt ein RNA-Genom, das sich nach Umschreibung in DNA als´Provirus´ mit einem Chromosom der Wirtszelle verbindet. Durch Nutzung des chromosomalen Apparates wird zwagsläufig korrekte Segregation erreicht. Weiter zeigte sich, dass der enzymatisch katalysierte Integrationsprozess an Orten erfolgt, die eine langanhaltende Hochexpression gewähren. Die eingehende Charakterisierung zahlreicher Ereignisse ergab die Integration an Matrix-Haftstellen der betroffenen Zelle, d.h. in unmittelbarer Nachbarschaft zu S/MARs (Abb. 1, Ereignis 2). Neben der direkten Nutzung von S/MARs nach Abb. 2 ergab sich damit auch die Möglichkeit, Retroviren als “Wegweiser” zu verwenden und ihnen eine “Adresse” mitzugeben. Von dieser Möglichkeit wird im abschließenden Kapitel des Aufsatzes die Rede sein.

- Simian Virus 40 (SV40)
Dieses Virus wurde um 1960 in Affennierenzellen entdeckt, wo es in Form einer ringförmig geschlossenen, nucleosomal organisierten DNA repliziert. Dieser episomale Zustand wird durch Virusproteine aktiv aufrechterhalten. Da hir besonders das “T-Antigen” tumorauslösende Eigenschaften aufweist, verbietet sich der direkte Einsatz dieses Systems für die meisten Zwecke.

In einer intensiven Zusammenarbeit [3] konnten wir einen Abkömmling dieses Episoms herstellen, welcher, unabhängig von viralen Proteinen, den Replikationsapparat der Zelle ĂĽber ein S/MAR Element nutzbar macht. Gleichzeitig wird eine Segregation nach dem “Huckepack-Prinzip” dadurch erzielt, dass sich der Vektor an ein Chromosom heftet. Der derzeitige Erkenntnisstand lässt hoffen, dass nach einer Etappe weiterer Verbesserungen ein universell einsetzbares Vehikel entsteht, das sich den variablen Bedingungen einer Zellkultur (Einfrier-Auftauzyklen, verschiedene Kultivations- und Wachstumsverhältnisse) gewachsen zeigt.  

Bis zum Erreichen dieses Ziels folgen wir den Strategien eines Retrovirus und fragen uns: wie lässt sich ein einmal charakterisierter, vorteilhafter chromosomaler Integrationsort so markieren, dass er wiederverwendbar wird [4]? 

Werkzeuge der Hefe werden verfeinert
In der Hefe gibt es ein episomales Gebilde, den “2-micron circle”, dessen Überleben durch eine Rekombinase mit ungewöhnlichen Eigenschaften garantiert wird . Dieses Enzym bewirkt den ´crossover´ zweier identischer, kurzer Erkennungsstellen (Flp-recombinase targets, FRT; Halbpfeile in Abb. 3). Das Spektrum der Rekombinationsmöglichkeiten zwischen zwei solchen Stellen ist begrenzt und umfasst (je nach der relativen Orientierung) Inversion, Deletion oder eine ineffiziente Addition (Integration). Wir haben in zurückliegenden Arbeiten Mutanten (Fn) dieser FRT-Stellen (F) hergestellt, die untereinander ein effizientes “crossover” nach dem Vorbild des Wildtyps ermöglichen. Eines zeigen sie nicht: eine Kreuzrekombination mit der Wildtyp-Sequenz F, die zur Deletion führen würde [5]. Damit befinden wir uns in der Situation der Abb 3:

 

Abb. 3:

RMCE (´recombinase-mediated cassette exchange´). In Verbindung mit Sätzen aus zwei unterschiedlichen FRT -Stellen (Halbpfeile) ermöglicht die Flp -Rekombinase aus Hefe den glatten Austausch zweier Expressionskassetten. Man beachte die Rekombinationsereignisse zwischen jeweils gleichen Erkennungsstellen, die genomisch verankert bzw. auf einem Austauschvektor gelegen sind. Der Einschub zeigt die Sequenzen der FRT(-Varianten) und vergleicht die homogene Expression eines durch RMCE erzeugten Klons (rechts unten) mit dem Ergebnis einer Standard-Transfektion, bei der ein Kontinuum und verschieden stark produzierender Zellen entsteht (weiter Bereich von Abszissenwerten).

 

 

    - ein beliebiges Gen (hier ein komplexer Selektionsmarker) wird durch einen Satz aus FRT-Stellen, Fn und F umgeben; nach seiner EinfĂĽhrung in das Genom der Wirtszelle werden die Eigenschaften verschiedener Integrationsstellen charakterisiert und besonders geeignete Klone isoliert;

    - das eigentlich interessierende Gen (GOI, ´gene-of-interest´) wird zwischen einen entsprechenden Satz an Fn und F Stellen kloniert und als Teil eines zirkulären Vektors in die Wirtszelle transferiert. Flp Rekombinase wird nun genutzt, um einen doppelt-reziproken ´crossover´ zu induzieren. Diese Methode dirigiert in einem “RMCE” (recombinase-mediated cassette exchange, “Kassettenaustausch”) genannten Ansatz das interessierende Gen exakt an den vorbestimmten Ort - ein Prozess, der sich beliebig oft mit unterschiedlichen Konstrukten wiederholen lässt.

 Dieses neuartige RMCE-Verfahren ist nicht nur fĂĽr die gezielte Modifikation biotechnologisch bedeutender Zelllinien einsetzbar [4], sondern erlangt auch zunehmend Bedeutung fĂĽr die systematische Modifikation von Stammzellen, z.B. mit der Absicht, gezielt transgene Tiere herzustellen [6].

Silke Winkelmann, Kristina Nehlsen, André Oumard, Martin Klar, Sandra Götze, Karin Maaß, Jürgen Bode (07.10.2003)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Literatur:
[1] F. O. Fackelmayer (2000) Biospektrum 6, 441-444  Die Architektur des Zellkerns.
[2] J. Bode, S. Goetze, H. Heng, S. A. Krawetz and C. Benham (2003)  J. Chromosome Res. 11. 435 -445. From DNA structure to  gene expression: Mediators of nuclear compartmentalization and -dynamics.
[3] H. J. Lipps, A. C. W. Jenke, K. Nehlsen, M. Scinteie, I. M. Stehle and J. Bode (2003) Gene, 304, 23 -33. Chromosome-based vectors for gene therapy. 
[4] J. Bode, S. Goetze, E. Ernst, Y. Huesemann, A. Baer, J. Seibler and C. Mielke (2003) Chap 20, pp551-572, Architecture and utilization of highly-expressed genomic sites in "New Comprehensive  Biochemistry 38" G. Bernardi, Ed. “Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells", S. Makrides, Volume Ed., Elsevier Amsterdam
[5] J. Bode, T. Schlake, M. Iber, D. SchĂĽbeler, J. Seibler, E. Snezhkov and L. Nikolaev (2000) Biol Chem. 381, 801-813. The transgeneticist´s toolbox  - Novel methods for the targeted modification of eukaryotic genomes. 
[6] F. Cesari, V. Rennekampff, K. Vintersten, L. Vuong, J. Bode, J. Seibler, F. F. Wiebel and A. Nordheim (2003) Genesis in press. Site-directed mutagenesis of the murine Elk-1 locus by RMCE.

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